自動セル

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 19873 (2022) この記事を引用

651 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究は、正常な細胞の生理機能や活動への影響を最小限に抑えながら、細胞の後方散乱信号のパターンを分析することにより、細胞の種類に基づいて生細胞を自動的に分類することを目的としていました。私たちのこれまでの研究では、高いパルス繰り返し周波数（PRF）の高周波超音波を使用したラベルフリーの音響センシングにより、不均一なサンプルから単一の物体を捕捉して分析できることが実証されています。ただし、後方散乱信号の積分後方散乱 (IB) 係数を後処理する際に、手動設定で起こり得るエラーや時間のかかるプロセスを排除することが重要です。この研究では、ラベルフリーの音響センシング技術と深層学習を活用した人工知能モデルを組み合わせた自動細胞型分類システムが提案されています。信号のノイズを除去するために 1 次元 (1D) 畳み込みオートエンコーダを適用し、ガウスノイズ注入に基づいてデータ拡張を実行して、提案された分類システムのノイズに対する堅牢性を強化しました。続いて、波形および周波数スペクトル解析用の 1D CNN モデルとスペクトログラム解析用の 2 次元 (2D) CNN モデルを含む、3 種類の信号データ表現の畳み込みニューラルネットワーク (CNN) モデルを使用して、ノイズ除去された後方散乱信号が特定のセルタイプに分類されました。我々は、後方散乱信号パターンを分析することにより、2 種類の細胞 (RBC と PNT1A など) と 2 種類のポリスチレン微小球を分類することにより、提案されたシステムを評価しました。私たちは、直径や構造材料などの実験変数を制御することにより、後方散乱信号に反映される細胞の物理的特性を発見することを試みました。さらに、ベースライン手法の精度と精度を比較することで、ニューラルネットワークモデルの有効性とデータ表現の有効性を評価しました。したがって、提案されたシステムを使用すると、個別化されたがん治療薬の開発のために、異なる固有の物理的特性を持ついくつかの細胞型を確実かつ正確に分類することができます。

Cell separation from a heterogeneous mixture of cells is critical for cancer research and new personalized drug development1,2,3,4,5,6,7. The precise isolation of distinct cell types provides a better understanding of cellular functions and roles in biological systems, and enables the identification of specific cell populations involved in disease progression and treatment response1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12. Cell separation techniques have been developed based on cell-surface markers, such as fluorescent dyes13,14,3.0.co;2-l (1999)." href="/articles/s41598-022-22075-6#ref-CR15" id="ref-link-section-d37727848e490"> 15、および特異的抗体16、17、またはサイズ、密度、圧縮率などの細胞固有の物理的特性18、19、20、21。これらの技術の中でも、固有の物理的バイオマーカーに基づくラベルフリー細胞選別法は、目的の細胞を識別するために集中的な作業や特定の細胞表面標識を必要としないため、広く使用されています。したがって、蛍光活性化細胞選別や磁気活性化細胞選別などの従来の標識支援細胞選別法と比較して、正常な細胞の生理機能および活性に対する望ましくない副作用を最小限に抑えることができます18、19。光ピンセットやマイクロ流体プラットフォームなどのアプローチにより、効果的かつ確実に細胞を分離できます。しかし、これらの方法には、強い光強度の使用に伴う光熱効果、難しい技術、微細構造内の構造的不規則性による細胞機能や応答に対するせん断応力、スティクション、遮断などの望ましくない影響などの重大な制限があります。 22、23。

超音波ベースの音響ピンセットは、比較的シンプルで費用対効果の高い実験設定で、単一細胞を捕捉したり、後方散乱係数として細胞の物理的特性を測定したりできることが最近実証されました 24、25、26、27。それぞれの手順で同じトランスデューサーまたは異なるトランスデューサーを使用して、トラップされた単一細胞からの後方散乱信号を安全に操作および取得するには、より長い超音波パルスとその後の短いパルスが必要です。ただし、トラップされた単一細胞の正確な測定は、実験設定とともに 2 つの異なるパルスシーケンスを使用することが避けられないため困難であり、誤解を招く情報をもたらす可能性があります。この重大な制限に対処するために、標的の単一細胞を捕捉し、その後方散乱信号を測定するために、高いパルス繰り返し周波数 (PRF) で高周波超音波を使用する音響ピンセットが開発されました 28。高いPRFの単サイクル超音波パルスは、より長いパルスで過剰な音響エネルギーを伴う従来の音響ピンセットと比較して、低いレベルの音響捕捉力で、標的の単一細胞を捕捉することができます。さらに、トラップされた単一ミクロンサイズの物体からの後方散乱信号を同時に測定して、5 および 10 \(\upmu\)m などの 2 つの異なるマイクロビーズ直径と、赤血球 (RBC) を含む 2 つの異なる細胞直径を識別できます。）直径6〜8 \(\upmu\)mの正常なSV40不死化前立腺上皮（PNT1A）細胞と直径9～11 \(\upmu\)mで、細胞の生存率を損なうことはありません。ただし、測定された後方散乱信号に基づく統合後方散乱 (IB) 係数の後処理は、通常、時間がかかるプロセスであり、トラップされた単一の物体によって生成される最初の超音波信号と小さな反射超音波信号の間の反射信号時間を手動で設定するため、エラーが発生する可能性があります。。さらに、IB 係数は散乱体の体積からの後方散乱エネルギーと平らな石英ターゲットからの後方散乱エネルギーの比として定義されるため、巨大な反射超音波信号は薄いマイラーフィルムから発生します。手動分析によって引き起こされる制限を克服するために、この研究ではディープラーニングを活用した人工知能モデルを採用し、後処理を最小限に抑えています。

生細胞の特性を分析するには、ヒューリスティックベースの手動分析、従来の機械学習 (ML) 手法、深層学習モデルなど、いくつかのアプローチを使用できます。まず、ヒューリスティックなアプローチはシンプルで直観的ですが、固有の制限があります。さらに、従来の ML アルゴリズムには、セル特性と観測データの相関関係を表現するための十分な機能がありません。最後に、最先端 (SOTA) 深層学習モデルは高い表現力を備えていますが、生細胞から収集するのが難しい大量のトレーニングデータを必要とします。私たちのこれまでの研究では、比較的浅い畳み込みニューラルネットワーク (CNN) モデルが、細胞の顕微鏡画像を比較することで細胞の剛性や細胞膜の構造などの細胞の物理的特性を調査するための効果的かつ効率的なソリューションとなり得ることを実証しました29,30。高周波超音波ビームを照射した後。 VGG (Visual Geometry Group) のような 31 CNN モデルをバックボーンとして使用し、浸潤性と細胞の近似ヤング率に基づいて乳がん細胞を高精度で分類することに成功しました。以前の研究からインスピレーションを得て、私たちは、ニューラルネットワークモデルが、標的の物体からの後方散乱信号のパターンに基づいて、ミクロンサイズの単一の物体を識別して分離できるかどうかを判断することに焦点を当てました。

この研究では、捕捉された単一の物体のラベルフリーの音響センシングとともに、現在の後処理パイプラインのいくつかの側面を改善することにより、自動化された細胞型分類のためのアプローチを提案します。当社の CNN モデルは、後方散乱信号を分析することで細胞の物理的特性を発見できます。さらに、CNN モデルは、周囲の物体から反射された信号など、生の信号のノイズに対して堅牢であることが期待されます。実験では、ラベルフリーの単一細胞解析システム 28 を使用して後方散乱信号を収集し、CNN オートエンコーダーを使用して生の後方散乱信号をノイズ除去し、CNN バックボーンと完全に接続されたニューラルネットワークを使用してノイズ除去された信号を分析することで細胞を細胞タイプに分類しました。

さらに、以前の研究 28 では細胞の直径が後方散乱信号に影響を与えることが示されていますが、細胞の他の側面がどのように後方散乱信号の違いにつながるのかを探るためにはさらなる研究が必要です。したがって、後方散乱信号に影響を与える他の細胞の特性と、ニューラルネットワークモデルがこれらの特性を捕捉できるかどうかを明らかにすることを試みました。ノイズ除去された信号は、波形信号、フーリエスペクトル、およびスペクトログラムに変換されました。続いて、提案された CNN バックボーンを使用して、変換された信号から時間、周波数、および時間-周波数ドメインの特徴を抽出しました。各バックボーンは後方散乱信号のそれぞれの特徴に焦点を当てているため、細胞とポリスチレン微小球を種類と物理的特性に応じて分類する際のバックボーンの性能を調べることで、信号特性の違いを引き起こす細胞特性の種類を推測できます。したがって、次の研究課題に基づいて提案されたシステムを評価しました。

RQ 1. 細胞は、その種類に応じて後方散乱信号の独特のパターンを持っています。

RQ 2. 周波数スペクトル解析は、後方散乱信号の特性を発見するのに役立ちます。

RQ 3. 周波数スペクトルの時間的変化は、後方散乱信号のパターンを分析するのに重要です。

RQ 1 は、自動細胞型分類用に提案されたニューラルネットワークモデルのパフォーマンスによって検証されています (表 1)。後方散乱信号に影響を与える細胞の特性を調べるために、次のようなより詳細な実験を実施しました: (1) 異なる直径を持つ細胞タイプ (表 1)、(2) 異なる直径を持つポリスチレン微小球 (表 2)、および (3) ミクロンの区別異なる物理的特性と同様の直径を持つサイズの物体 (表 3)。時間領域解析 (つまり、生の信号に 1 次元 (1D) CNN を適用する) のパフォーマンスを周波数領域解析のパフォーマンスと比較することで、RQ 2 を検証しました (表 1、2、3)。さらに、スペクトログラムと周波数スペクトル解析を比較して、RQ 3 を検証しました (表 1、2、3、および図 5)。さらに、ノイズは提案されたモデルのパフォーマンスを著しく妨げるため、アブレーションテストを使用して対処する必要があることを実証しました（表4）。

この文書の残りの部分は次のように構成されています。「材料と方法」セクションでは、生細胞から後方散乱信号を収集するために使用されるラベルフリーの単一細胞解析システム、生の後方散乱信号のノイズを除去するために提案されたオートエンコーダーモデル、および後方散乱信号から細胞の特性を発見するために提案された CNN バックボーンについて説明します。「結果」セクションでは、提案された分類システムを評価し、研究課題を検証するための実験手順と結果を示します。議論、結論、および今後の研究の方向性は、「議論と結論」セクションに示されています。

2 種類の細胞 (PNT1A および RBC) とポリスチレンマイクロスフェア (5 \(\upmu\)m および 10 \(\upmu\)m) の後方散乱シグナルは、ラベルフリーの単一細胞解析システムを使用して収集されました28。私たちは、人工ニューラルネットワークに基づくノイズ除去オートエンコーダーと分類器を適用して、後方散乱信号が特定のタイプの細胞を他の細胞から区別する際に顕著に特徴的であるという仮説を検証しました。後方散乱信号は提案されたオートエンコーダーモデルによってノイズ除去され、CNN 分類器は時間領域または周波数領域の分析からセルの特性を検出するようにトレーニングされました。

Figure 1a demonstrates experimental setup for label-free single-cell isolation and analysis composed of a custom-built tightly focused high-frequency ultrasound transducer operated with its impedance matching network along with custom-built front-end system, a three-dimensional (3D) linear stage, an oscilloscope, and an inverted fluorescence microscope with an image acquisition and analysis tool28. The lithium niobate (\(LiNbO_3\))-based highly focused high-frequency transducer with an aperture size of 2.6 mm and focus number of 0.75 was designed and fabricated according to the transducer fabrication process32. The attachable impedance matching network was developed to maximize energy transfer efficiency between the transducer and the custom-built front-end system33. The location of the custom-built high-frequency transducer with the impedance matching network was precisely adjusted by 3D linear stage (SGSP 20, Sigma KOKI Co., Japan) controlled by a customized LabVIEW (National Instruments, Austin, TX, USA) program. A custom-built front-end system developed in compact and cost-effective printed circuit board (PCB) board was comprised of a transmitter for generating high-frequency (\(\ge 100\) MHz) and high-PRF (\(\le 1\) MHz) monocycle bipolar pulses, a receiver with an enhanced signal-to-noise ratio for amplifying considerably weak backscattering signals, and diode-based expander and limiter for protecting the transmitter and receiver, respectively28, 100 MHz) ultrasound applications. in Proceedings of the 2013 IEEE International Ultrasonics Symposium (IUS 2013), 1567–1570. https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2013.0399 (IEEE, Prague, Czech Republic, 2013)." href="#ref-CR34" id="ref-link-section-d37727848e3910"> 34、35、36。音響的に透明なマイラーフィルム上に捕捉された単一の物体からの後方散乱信号は、オシロスコープ（104MXi、LeCroy、サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を使用して10 GHzのサンプリングレートで記録されました。画像取得および分析ツール (Metamorph、Molecular Devices、米国カリフォルニア州サニーベール) を備えた倒立蛍光顕微鏡 (IX71、オリンパス、ペンシルバニア州センターバレー) を使用して、高強度を実証するための時間分解明視野画像を取得しました。周波数超音波パルスによって粒子や細胞などの単一の物体を捕捉し、移動させること。

ラベルフリーの単一細胞分離分析システム。 (a) インピーダンスマッチングネットワークを備えた高周波超音波トランスデューサー、カスタムビルドのフロントエンドシステム、3次元リニアステージ、オシロスコープ、画像取得および分析ツールを備えた倒立蛍光顕微鏡で構成される実験セットアップ。 (b) カスタム構築されたフロントエンドシステムの測定されたパルス波形とそのスペクトル。 (c) インピーダンス整合ネットワークを備えた高周波超音波トランスデューサーの測定されたパルスエコー波形とそのスペクトル。 (d – f) インピーダンス整合ネットワークを備えた高周波超音波トランスデューサーの測定された空間超音波圧力。

図1bは、中心周波数200 MHz、帯域幅110～290 MHzの単サイクルバイポーラパルスを生成できるフロントエンドシステムの測定された性能を表しています。インピーダンス整合ネットワークを備えた開発された高周波超音波トランスデューサの性能は、脱気および脱イオン水中で、平坦な石英を使用したパルスエコー応答と、直径 2.5 \(\upmu\)m のタングステンワイヤを使用したワイヤファントムイメージングによって測定されました。。図1cのパルスエコー応答から、インピーダンス整合ネットワークを備えた高周波超音波トランスデューサーの測定された中心周波数と \(-6\) dB 帯域幅は、それぞれ153 MHzと144〜162 MHzでした。測定されたトランスデューサ焦点の軸方向寸法と横方向寸法は、それぞれ 28.5 \(\upmu\)m で、以下に基づく圧力場の半値全幅 (FWHM、\(-6\) dB 圧力) によって定義されます。図1d〜fに示すワイヤーターゲット画像。

さらに、ターゲットの単一物体を捕捉するための高 PRF での単サイクル超音波パルスの能力が図 2 に実証されました。音響捕捉力校正システムは、圧力コントローラー (ez-gSEAL 100B、Neobiosystem、カリフォルニア州、米国)、ガラスを使用して開発されました。フィラメント付きキャピラリー (GD-1、米国ニューヨーク州ナリシゲ)、および垂直マイクロピペットプーラー (PC-10、ニューヨーク州ナリシゲ)37,38,39。パルス長 6.7 ns の単サイクル電気パルスによって生成された \(122.4 \pm 13.4\) nN (\(n = 3\)) の音響捕捉力を測定し、167 kHz の PRF で 50 V の入力電圧を印加し、同時に有効にしました。マイクロスフェア、RBC、およびPNT1A細胞をトランスデューサーの方向に沿って捕捉および移動させ、捕捉された単一の物体からの後方散乱信号を取得します。

高周波超音波トランスデューサーの動きによる、（a〜c）ターゲットの単一ポリスチレン微小球、（d〜f）RBC、および（g〜i）PNT1A細胞の音響トラップ。黄色と赤色の破線の円は、それぞれトランスデューサーの最初の位置と移動した位置を示します。画像のスケールバーは、(a – c) 100 \(\upmu\)m および (d – i) 20 \(\upmu\)m を示します。

インフォームドコンセントフォームを提供した健康なボランティアから新鮮なヒト血液サンプルを入手しました。得られた血液を用いたすべての実験は、南カリフォルニア大学の治験審査委員会 (IRB) によって承認されたガイドラインと規制に従って実施されました (UP-16-00713)。採取した全血をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）（Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて 500g で 10 分間遠心分離し、RBC を分離しました。上清を穏やかに除去した後、PBS中のRBCを再度遠心分離し、PBSとアルセバー溶液の混合溶液に再懸濁した。 10\(\%\) のウシ胎児血清を添加した RPMI 1640 で培養した PNT1A 細胞 (Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国) を、加湿器を備えた 37 \(\circ\)C のインキュベーター内で単層として増殖させました。 5\(\%\) CO\(_2\) の雰囲気。 PNT1A細胞をPBSで2回穏やかに洗浄し、インキュベーター内でTrypLE溶液を5分間分注し、150×gで5分間遠心分離して細胞を分離した。上清を穏やかに除去した後、PBS 中の PNT1A 細胞を再度遠心分離し、Ca\(^{2+}\) (Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム) を含むダルベッコ PBS に再懸濁しました。

マイラーフィルムなどの周囲の物体からの信号の中に細胞からの後方散乱信号を正確に捕捉することは困難であったため、当初は他の周囲の物体からの反射に埋もれた細胞からの後方散乱信号を回復するプロセスを実施しました。最近、この問題を解決するために、ノイズ除去オートエンコーダモデルが広く採用されています 40,41。人工ニューラルネットワークアーキテクチャであるオートエンコーダーは、入力データから抽出された特徴を低次元の特徴ベクトル (または行列/テンソル) に圧縮し、特徴ベクトルから元の入力を復元します。特徴ベクトルの次元により、オートエンコーダーは入力のすべての詳細を復元することはできず、特有の特徴のみが出力に残ります。

\(n+1\) 番目の入力と n 番目の出力を考慮して \(n+1\) 番目の出力を生成するリカレントニューラルネットワーク (RNN) モデルは、逐次データの分析に広く使用されてきました。 RNN メカニズムは入力サンプル間の時間的相関を学習するのに効果的ですが、長期依存問題 42 と呼ばれる固有の制限も引き起こします。この問題により、以前の入力は後の入力よりも優先度が低くなり、最終的には忘れられてしまいます。セルの特性は後方散乱信号の最後の数サンプルには反映されないため、すべてのサンプルをまとめて解析できるモデルが必要です。したがって、ノイズ除去には 1D 畳み込みオートエンコーダーを使用しました。信号内のすべてのサンプルについて、1D 畳み込み演算により、時間的に隣接するサンプルに関する情報が蓄積されます。各畳み込みフィルターはローカルコンテキストに焦点を当てていますが、畳み込み層を積み重ねることによって信号のグローバルな特徴を抽出できます。したがって、1D 畳み込みオートエンコーダーはリカレントオートエンコーダーの制限を克服でき、2D 畳み込みオートエンコーダーモデルや完全接続オートエンコーダーモデルよりもシーケンシャルデータに適しています。さらに、信号から大域的な特徴を効率的に発見するために拡張畳み込みを採用しました。

拡張された畳み込み層は、隣接するピクセルまたはサンプルのみを観察する従来の操作の受容野を拡張します。したがって、時間的に離れた 2 つのサンプルに相関がある場合、一方のサンプルからもう一方のサンプルに情報を伝播するには多数の層が必要になります。拡張畳み込みは、畳み込み演算の受容野を拡張することでこの問題を解決できます。一度に広い範囲を観測することで、レイヤー数を減らしながら、離れたサンプル間の相関関係を解析することが可能になりました。 Samal et al.43 は、ダウン/アップサンプリング層を畳み込み層に置き換える 1D 畳み込みオートエンコーダモデルを提案しました。このアプローチにより、受容野は広くなりますが、計算コストが高くなります。表 4 の実験結果は、現在のパラメーター数が細胞の後方散乱信号の特性を学習するのに十分であることを示しています。

図3aに示すように、提案されたオートエンコーダモデルのエンコーダ部分は、6つの拡張1D畳み込み層、3つの最大プーリング層、および2つの完全接続層で構成されます。エンコーダによって生成された圧縮特徴ベクトル Z から、デコーダは 7 つの拡張 1D 畳み込み層と 3 つのアップサンプリング層を使用して元の信号を復元します。これは次のように定式化できます。

ここで、X はセルから取得された生の信号、\(\hat{X}\) は特徴ベクトルから復元されたノイズ除去された信号、\(W_e\) と \(W_d\) はエンコーダーのパラメーターセットを示し、それぞれデコーダ。 \(f(\cdot ;\cdot )\) と \(g(\cdot ;\cdot )\) はそれぞれエンコーダとデコーダを表します。提案されたオートエンコーダの層の活性化関数は修正線形単位 (ReLU) であり、平均絶対誤差 (MAE) 損失と Adam オプティマイザー 44 がオートエンコーダのトレーニングに採用されました。図 4a ～図 4d は、提案されたオートエンコーダが生の信号の高周波特徴を回復することを示しています。ただし、表 4 に示すように、ノイズ除去オートエンコーダーのみを使用しても、セル分類の精度には大きく貢献しません。

提案された CNN モデルの構造。提案されたシステムは、図 1 の高周波超音波トランスデューサ、(a) のノイズ除去オートエンコーダ、(b) と (c) の CNN 分類器の 3 つの主要コンポーネントで構成されます。ノイズ除去オートエンコーダーはノイズを低減し、高周波超音波トランスデューサーによって収集された後方散乱信号の潜在的な特徴を強調します。ノイズ除去された信号は FFT または STFT によって処理されました。波形解析では、ノイズ除去された信号に対する追加の処理は実行しませんでした。次に、信号 (またはスペクトル/スペクトログラム) が CNN モデルへの入力となり、細胞の種類に応じて細胞を分類します。

提案されたノイズ除去オートエンコーダーモデルの結果。左側の図は PNT1A 細胞のスペクトログラム、右側は RBC のスペクトログラムです。 X 軸と Y 軸はそれぞれ時間と周波数を示します。また、色の明るさとは、周波数成分の強さを指します。時間単位は信号の 16 サンプルに対応し、周波数と強度の単位はそれぞれ Hz と dB です。 (a) と (b) は元の信号から抽出されたスペクトログラム、(c) と (d) は 1D CNN を使用したノイズ除去オートエンコーダーに基づいており、(e) と (f) はノイズ除去オートエンコーダーとガウス分布を使用した場合です。ノイズ注入も併用されました。

ガウスノイズ注入により、ノイズ低減と分類の段階でノイズと周囲に対する提案システムのロバスト性を強化できます45。図 3a に示すように、元の信号 X は、確率的マッピング \(\tilde{X} \sim q(\tilde{X} \mid X) によってノイズのある信号 \(\tilde{X}\) に破損します。 \) とガウスノイズ \(n \sim N(0, \sigma _n^2)\)。破損した信号は、特徴 Z を抽出するためのエンコーダーへの入力データとして使用され、次のように再構築されたノイズ除去結果 \(\hat{X}\) を取得しました。

また、ノイズはランダムに発生するため、入力信号の数を増やすことができます。このデータ拡張プロセスを通じて、後方散乱信号の特徴的なパターンを冗長ノイズから区別するようにオートエンコーダーをトレーニングできます。この拡張手法をノイズ除去と分類器に適用しました。図 4 は、RBC および PNT1A 細胞から収集された生の信号の例、提案されたオートエンコーダーの結果、およびガウスノイズがオートエンコーダーの入力に注入されたケースを示しています。

この研究では、細胞の後方散乱信号を細胞の種類に分類するための高度なニューラルネットワークアーキテクチャは採用されていません。 SOTA 深層学習モデルのパフォーマンスは高いにもかかわらず、生きた細胞からこれらのモデルをトレーニングするために必要な大規模なデータを収集するのは困難です。私たちの以前の研究29、30で実証されたように、比較的浅いニューラルネットワークモデルは、限られた量のデータで生細胞を分析するための効率的かつ効果的なソリューションとなり得ます。 CNN モデルの構造は VGG1631 の構造と似ていますが、受容野を拡張し、過剰適合を防ぐための技術が採用されています。細胞の後方散乱信号のパターンは、時間領域信号と周波数領域信号の両方において、肉眼ではそれほどはっきりと見えませんでした (図 4)。ただし、提案された CNN モデルは、ノイズに埋もれたパターンを効果的に復元しました。

VGG1631 では、畳み込みカーネルのサイズを \(3\times 3\) に固定し、ネットワークの深さを増やすことで分類精度が向上します。小さなフィルターで複数の畳み込みを実行すると、大きなフィルターでいくつかの畳み込み層を使用する場合と比較して、パラメーターの数が減ります。このアプローチにより、トレーニング効率が向上し、過剰適合のリスクが軽減されました。同時に、レイヤーの数が増加するにつれて、CNN モデルは入力データのより広い領域から非線形特徴を抽出できるようになりました。

ただし、後方散乱信号内の隣接するサンプルから特徴を抽出すると、信号の全体的な特性を捕捉することが困難になります。この問題に対処するために、Lu et al.46 は、ResNet47 と拡張コンボリューション 48 を使用することで神経膠腫の分類パフォーマンスを向上させました。これにより、コンボリューションカーネルのサイズを増やすことなく、より大きな受容野を得ることができます。 Chen ら 49 は、U-Net50 とコンピュータ断層撮影 (CT) 画像の拡張畳み込みを組み合わせた肺セグメンテーション法を提案しました。拡張畳み込みと融合した VGG のようなモデルを細胞の後方散乱信号に適用して、畳み込みフィルターの受容野を拡張しました。したがって、少数の畳み込み層とパラメーターのみを使用して、ローカルとグローバルの両方の観点を考慮した信号特徴を取得しました。

さらに、各層のパラメータがエポックに基づいて更新されたため、各層の入力分布が変化しました。そのため、ニューラルネットワークモデルが深化するにつれて入力分布が大きく変動し、パラメータの学習が不安定になってしまいました。したがって、学習速度と効率を向上させるために層の出力を正規化するバッチ正規化51を各層に適用しました。さらに、重み、バイアス、ドロップアウト層の正則化と初期化を採用して、トレーニング効率を高め、過学習を防止しました。提案されたニューラルネットワークモデルの詳細なアーキテクチャについては、このセクションの残りの部分で説明します。

同じ 1D CNN 分類器を適用して、ノイズを除去したセルの後方散乱信号の波形と周波数スペクトルを分析しました。 1D CNN 分類器は、図 3b に示すように、7 つの拡張 1D 畳み込み層、3 つの全結合層、7 つのドロップアウト層、および 4 つの最大プーリング層で構成されています。さらに、畳み込み層ごとにバッチ正規化を実行し、畳み込み層と全結合層の重みとバイアスの両方に L2 正則化とザビエル正規化 52 を適用しました。

細胞から後方散乱信号を収集する方法に関する既存の研究 28 では、細胞/粒子のサイズが後方散乱信号の周波数スペクトルに影響を与えると推測されていました。さらに、前のセクションで説明したように、ラベルフリーの単一細胞分析システムは、非常に短い時間にわたって高周波超音波マイクロビームを細胞に照射します。したがって、図4に示すように、細胞からの後方散乱信号も信号全体に比べて非常に短いです。波形を直接解析すると、細胞からの実質的な信号を含む短い期間の探索がさらに負担になる可能性があります。ただし、周波数スペクトル解析ではこの点も考慮しました。したがって、周波数スペクトル解析は波形解析よりも高精度で安定した解析ができると期待されていました。

高速フーリエ変換 (FFT)53 を使用して、提案されたオートエンコーダモデルによってノイズ除去された後方散乱信号の周波数スペクトルを抽出しました。離散信号 \(\hat{X}(n)\) の場合、\(n \in [0, N-1]\)、N はサンプル数であり、その周波数スペクトル \(\hat{X} (f)\) と FFT は次のように定式化できます。

ここで、 \(i=\sqrt{-1}\) は虚数単位で、 \(f \in [0, N-1]\) は周波数成分に対応します。したがって、\(\hat{X}(f)\) は \(\hat{X}(n)\) における周波数 f の振幅を示します。 \(\hat{X}(f)\) は対称関数であるため、右半分のみを使用します。

周波数信号と波形信号は両方とも連続データでした。ただし、信号の全長は制御でき、これはセルからの実際の後方散乱信号よりもはるかに長く、後のサンプルまたは高周波成分は、初期のサンプルまたは低周波成分よりも重要ではありませんでした。したがって、以前の入力の揮発を引き起こす可能性がある RNN ではなく 1D CNN を使用して、時間領域と周波数領域で信号の局所的な特徴を抽出しました。次に、完全に接続された層は、細胞の種類に基づいて局所的な特徴の違いを発見するようにトレーニングされました。図 3b は、提案された 1D CNN 分類器の詳細な構造を示しています。この研究では、血液中のがん細胞 (PNT1A) と RBC を区別することにより、提案されたシステムを評価しました。したがって、出力層でシグモイド活性化とバイナリクロスエントロピー損失を使用しました。ノイズに対するシステムの堅牢性をさらに高め、過学習を防ぐために、提案されたオートエンコーダと同様に、ガウスノイズを使用してデータ拡張を実行しました。周波数スペクトル分析では、最初にガウスノイズを注入し、次に FFT を実行しました。周波数スペクトルと波形信号の両方について、1D CNN 分類器は次のように定式化できます。

ここで、 \(Y_i\) と \(\hat{Y_i}\) はそれぞれ、i 番目の入力信号 \(X_i\)、\(h_{1D}(\cdot) に対応する実際のセルタイプと予測されたセルタイプです。 ;\cdot )\) は提案された 1D CNN モデルを表し、\(W_c\) はモデルのパラメータセットを示します。

周波数成分の振幅と振幅の時間的変化は、それぞれ周波数スペクトルと波形信号で明らかになりました。時間周波数領域変換を使用して、周波数と振幅の特徴を同時に分析できます。私たちは、スペクトログラムと呼ばれるこの統合により、細胞のさまざまな特性を 1D 表現よりも正確に記述できると期待しています。スペクトログラムは、図4に示すように、時間周波数平面（2次元空間）での信号の強度を表します。変換には、部分的にFFTを連続的に行う短期フーリエ変換（STFT）54を採用しました。固定長のスライディングウィンドウを使用した信号。ウィンドウサイズが l、ステップサイズが d のとき、まず信号 \(\langle \hat{X}(0), \ldots , \hat{X}(l-1) \rangle\) に対して FFT を実行しました。となり、次の反復でウィンドウは \(\langle \hat{X}(d), \ldots , \hat{X}(d+l-1) \rangle\) に移動しました (この研究では \(l =32\) および \(d=16\))。その結果、各時間窓の周波数スペクトルが得られました。これは次のように定式化できます。

ここで、w(n) はウィンドウ関数、m は離散周波数変数です。生の信号は \(50\%\) のオーバーラップを持つ 9 つのセグメントに分割されました。各セグメントはハミングウィンドウでウィンドウ処理され、サンプルレートは 1,000,000 Hz でした。スペクトログラムは STFT の大きさの 2 乗です。

Zhu et al.55 は、1D CNN をスペクトログラムと長期短期記憶 (LSTM) の周波数領域分析に適用して、周波数スペクトルの時間的変化を分析しました。この畳み込み RNN アプローチには、データの時間特性を明示的な方法で表現するという利点があります。ただし、反復層は長期的な依存関係の問題を引き起こします。したがって、この研究では、細胞の種類が信号全体から区別される特徴的な局所構造を捕捉するために、拡張 2D コンボリューションをスペクトログラムに適用しました。

細胞の種類を分類するという同じ問題を時間周波数領域で分析したため、前のセクションで示した 1D CNN モデルの構造の次元数を拡張することによって 2D CNN モデルが構築されました。 2D CNN 分類器と 1D CNN の主な違いは、次元数の増加によるパラメーターの数ですが、それらの構造はほぼ同じです。

図 3c は、提案された 2D CNN 分類器のアーキテクチャを詳細に示しています。セルタイプのバイナリ分類の場合、出力層の活性化関数と損失関数は、それぞれシグモイド活性化とバイナリクロスエントロピー損失です。 SFTF を生の信号に適用する前に、1D CNN 分類器と同様に、ノイズと過学習に対する分類器の堅牢性に対処するために、ガウスノイズを使用したデータ拡張を実行しました。したがって、信号のスペクトログラムの 2D CNN 分類器は、式 1 と同様の方法で定式化できます。 (4)。

私たちは、提案されたシステムを生細胞 (RBC および PNT1A) の分類に適用することで、研究課題を検証しました。既存の超音波装置（ラベルフリー単一細胞解析システム）と従来のCNNモデルを組み合わせた提案システムの意義は、細胞の後方散乱信号を解析することにより細胞型分類を自動化することにある。したがって、最初に、提案されたシステムが生細胞を他の細胞または粒子から区別できるかどうかを調べることによって、後方散乱信号（RQ 1）の区別性を検証しました（表1、2、3）。信号解析では、信号の前処理に基づいた 3 つのアプローチ (波形解析、周波数スペクトル解析、スペクトログラム解析) を紹介しました。これらのアプローチには、前処理とモデルのトレーニングの計算の複雑さの点で長所と短所があります。そこで、追加の前処理がシステム全体 (RQ 2 および RQ 3) のパフォーマンスに寄与するかどうかを検証しようとしました。この検証により、セルから後方散乱された信号の周波数および時間領域の特徴の重要性も明らかになりました (図 5)。さらに、図 4 に示すように、収集された信号にはノイズが多く、対象期間は非常に短いパルスでした。したがって、ノイズ除去技術のアブレーションテストを実行することにより、提案したシステムのノイズに対する堅牢性と、提案したオートエンコーダのシステムパフォーマンスへの貢献を評価しました（表4）。

精度 (A)、精度 (P)、再現率 (R)、および \(F_1\) の観点から提案されたモデルのパフォーマンス評価は、周波数分解能の関数として (\(F_1\)) を測定します。実線と点線は、それぞれ周波数スペクトル (Freq) とスペクトログラム (Freq+Temp) での信号のトレーニング結果を示します。

このセクションでは、データセット、評価メトリック、ハイパーパラメーター設定、ベースライン手法などの実験セットアップについて説明します。各細胞タイプについて 77 個のシグナル (RBC 細胞 12 個と PNT1A 細胞 12 個)、およびポリスチレン微小球について 146 個のシグナル (5 \(\upmu\)m の 17 個の微小球から得られた 72 個のシグナルと、10 \(\)m の 14 個の微小球から測定された 74 個のシグナルを収集しました。うむ\)m)。 RBC 細胞と PNT1A 細胞のサイズの平均と標準偏差は、それぞれ \(6.57 \pm 0.66\;\upmu\)m と \(10.10 \pm 0.88\;\upmu\)m で、5 \( \upmu\)m と 10 \(\upmu\)m のマイクロスフェアは、それぞれ \(4.98 \pm 0.06\;\upmu\)m と \(9.97 \pm 0.07\;\upmu\)m でした。微小球や細胞などの単一物体の後方散乱信号を、超音波によって音響的に捕捉された状態で測定しました。捕捉と測定が同時に行われるため、周囲の物体からの情報ではなく、ターゲットの物体のみから信号を取得することができ、これがこの技術の主な利点と考えられます。ただし、これらの複雑な実験手順により、大規模なデータセットを取得することが困難になります。データセットが小さいということは、音響ピンセットを使用した単一細胞解析の領域の本質的な制限であり 56、57、58、59、60、61、62、これがオーバーフィッティングの問題や実験結果のデータ信頼性につながる可能性があります。考えられる問題に対処するために、最初に 3 重交差検証を実施して、提案されたモデルが生細胞の多様性に対応できるかどうかを調べました。各実験では、ラベル (細胞やマイクロスフェアの種類など) の分布を維持しながら、データセットを 3 つの等しい部分に分割しました。すべての後方散乱信号がテストサンプルとして少なくとも 1 回使用されることを保証するために、各検証ケースではデータセットの 3 つの部分のうち 2 つをトレーニングデータとして使用し、残りの 1 つの部分をテストデータとして使用しました。続いて、ガウスランダムノイズを注入してデータセットを強化しました。トレーニングデータ内の元の後方散乱信号ごとに 10 個のノイズを含む信号を生成しました。

精度 (A)、適合率 (P)、再現率 (R)、および \(F_1\) 測定値 (\(F_1\)) の 4 つの評価指標を使用しました。 T が自動的に検出された PNT1A セルのセットを示し、\(T^*\) が実際の PNT1A セルのセットを示す場合、精度は次のように定式化できます。

ここで、U はデータセット内のセルのユニバーサルセットを示し、\(|\cdot |\) はセット内の要素の数を示します。

ノイズ除去オートエンコーダーモデルと分類器は、Python の Keras を使用して実装されました。私たちは、提案されたノイズ除去オートエンコーダーのハイパーパラメーターのグリッド検索を実行しました。エポック数 (\(\varepsilon\)): 100 ～ 300、ステップサイズ \(+50\)、学習率 (\(\rho\)): 0.0001 ～ 0.1、ステップサイズ \(\ 10 倍\)、バッチサイズ: 3 ～ 18、ステップサイズ \(+3\)、特徴ベクトル (Z) サイズ: 625 ～ 2500、ステップサイズ \(\times 2\)、およびノイズ係数 ( \(\sigma _n\)): 0.1 ～ 0.5、ステップサイズは \(+0.1\) です。提案されたモデルは、 \(\varepsilon\) が 200、 \(\rho\) が 0.01、バッチサイズが 12、特徴ベクトル (Z) サイズが 1250、 \(\sigma _n\) が 0.1 の場合に最高のパフォーマンスを示しました。。 STFT のハイパーパラメータも検索しました。ウィンドウサイズ (w): 8 ～ 64、ステップサイズ \(\times 2\)、オーバーラップサイズ: 2 ～ 16、ステップサイズ \(\times 2\)。グリッド検索に基づいて、ウィンドウサイズを 32、オーバーラップサイズを 16 と決定しました。分類器については、1D および 2D CNN でそれぞれプールサイズ 2 および (2, 2) の最大プーリング層を適用しました。、ドロップアウト率は 0.2 に設定されました。提案された分類器のハイパーパラメータは次のように選択されました。 \(\varepsilon\): 30 ～ 250、ステップサイズ \(+20\)、\(\rho\): 0.0001 ～ 0.1、ステップサイズ \(\times 10\)、バッチサイズ: 3 –18 (ステップサイズ \(+3\))。 CNN モデルは、1D と 2D CNN 分類器の両方で \(\rho\) が 0.001、バッチサイズが 15、\(\varepsilon\) が 50 で最高のパフォーマンスを示しました。

さらに、ニューラルネットワークモデルの必要性を実証するために、提案した分類器のパフォーマンスを、サポートベクターマシン (SVM)、ロジスティック回帰 (ロジット)、および多層パーセプトロン (MLP) を含む従来の ML アルゴリズムのパフォーマンスと比較しました。線形カーネル、多項式カーネル、放射基底関数 (RBF) カーネルの中から SVM の最適なカーネルを探索したところ、SVM 分類器は線形カーネルで最高のパフォーマンスを示しました。 100 個の隠れユニットと ReLU 活性化関数を備えた 5 つの隠れ層で MLP 分類器を構成しました。シグモイド活性化はこのモデルの出力層で使用され、その損失関数はバイナリクロスエントロピー損失でした。 MLP モデルのパラメータは、提案された分類器と同様に、それぞれ Xaiver 通常初期化 52 と Adam optimizer 44 を使用して初期化および更新されました。 CNN 分類器と同じ方法で MLP モデルのハイパーパラメータ検索を実行しました。 MLP 分類器は、\(\rho\) が 0.001、バッチサイズが 12、\(\varepsilon\) が 100 の場合に最高のパフォーマンスを示しました。

我々は、以下の実験に基づいて、提案されたシステムが細胞を他のミクロンサイズの物体から適切かつ効果的に区別できるかどうかを調査した：（1）異なる直径を持つ細胞タイプを分類する（例えば、RBCとPNT1A細胞）、（2）異なる直径を持つポリスチレン微小球を区別する直径 (例: 5 \(\upmu\)m と 10 \(\upmu\)m)、(3) 物理的特性が異なり、直径が類似しているミクロンサイズの物体を分類する (例: 5 \(\upmu\)m) RBC を含むミクロスフェアと PNT1A 細胞を含む 10 \(\upmu\)m ミクロスフェア)。実験結果から、後方散乱信号のパターンに反映される細胞の特性が明らかになりました。

提案されたモデルの有効性に基づいて、セルの後方散乱信号の一意性について RQ 1 を検証しました。我々は、提案された CNN 分類器を使用して PNT1A 細胞を RBC から区別することを試みました。後方散乱信号がサイズや構造材料などの細胞の重要な特性を反映している場合、分類器の精度は高くなりますし、その逆も同様です。表 1 に実験結果を示します。

表 1 の上部で説明したように、時間周波数ドメイン分析は、平均精度と分散の両方の点で 3 つの分類器の中で最高のパフォーマンスを示しました。周波数領域解析と時間周波数領域解析の両方で、2 番目と 3 番目の折り目で完璧な精度が示されました。逆に、周波数ドメインは、最初の折り目の他のドメインよりもわずかに精度が低かった。他の 2 つの分類器と比較して、波形信号に対して提案された分類器は、1 番目と 2 番目の折り目でわずかに低いものの、同様の精度を示しました。ただし、時間領域分析では 3 倍のパフォーマンスが低く、従来の ML 手法よりもさらに低いことが示されました。私たちは、3 番目のフォールドのテストデータには、周波数領域の特徴を使用してのみ区別できる信号が含まれている可能性があると想定しました。さらに、周波数領域の特徴は波形よりも異常なサンプルに対してより堅牢でした。それにもかかわらず、提案された分類器は、データ表現や精度メトリクスに関係なく、平均して高い分類精度 (\(\ge 0.88\)) を達成しました。したがって、実験結果は、後方散乱信号のパターンが特定の種類の細胞を区別するための効果的な特徴となり得ることを示しています (RQ 1)。

さらに、表 1 の下の部分に示すように、提案された分類器を従来の ML 手法と比較することで、深層学習を強化したモデルの必要性を検証しました。ノイズ除去と拡張を含む同じ前処理手法を、提案された分類器と同じ前処理手法を適用しました。公平な比較のための比較グループ。提案された分類器はベースライン手法を上回り、そのパフォーマンスの向上は、時間-周波数領域よりも時間および周波数領域の分析でより顕著でした。時間領域と周波数領域の特徴を組み合わせることで、細胞に関するより豊富な情報が分類器に提供される可能性があると想定しました。それにもかかわらず、この明らかな改善は、後方散乱信号内のセルの特性を従来の方法では明らかにすることが困難であり、CNN モデルの解析機能が必要であることを示しています。ハイパーパラメータ検索中、線形カーネルを使用した SVM は、他の非線形カーネルを使用した場合よりもわずかに高い精度 (\(F_1\) 測定に関して \(\le 0.02\)) を示しました。この点は、非線形モデルである提案された CNN 分類器が線形カーネルを使用した SVM を大幅に上回ったこととは対照的に見ることができます。ただし、SVM カーネル間の小さなパフォーマンスギャップとモデルアーキテクチャの違いを考慮すると、CNN 分類器のモデルの複雑さが高いため、SVM よりも信号特徴とセル特性の複雑な相関を表現できる可能性があります。同様の結果は、SVM が非線形であるロジスティック回帰と MLP の両方を一貫して上回ったり、下回ったりするわけではないという点でわかります。したがって、モデルの（非）線形性は、後方散乱信号の解析における有効性に対して、アーキテクチャよりも影響が小さいと想定します。 MLP は、波形と周波数スペクトルに関して、SVM やロジスティック回帰などの他のベースライン手法を上回りました。ただし、MLP はスペクトログラムのパフォーマンスを大幅に下回っており、MLP が周波数スペクトルの動的な変化などの連続的な特徴の分析には適していない可能性があることを示しています。

次に、提案されたモデルを使用して 2 つの異なるサイズのポリスチレン微小球 (直径 5 および 10 \(\upmu\)m) を分類し、構造材料の違いの可能性を排除してサイズの違いの影響に焦点を当てました。

以前の実験では、提案されたシステムがサイズや構造材料などの異なる物理的特性を持つ細胞を区別できることが実証されました。次に、構造材料の違いの可能性を排除して、サイズの違いの影響に焦点を当てました。提案したシステムを、同じ構造材料の異なるサイズのポリスチレン微小球に適用しました。このシステムは、後方散乱信号パターンを分析することにより、サイズ (5 および 10 \(\upmu\)m) に基づいて 2 種類のポリスチレン微小球を分類しました。表 2 は、ポリスチレン微小球に対して提案されたモデルの分類精度を示しています。

提案されたモデルは、さまざまなサイズのポリスチレン微小球を分類するのに高い精度と低い分散を示しました。この結果は、我々の以前の研究 28 と一致しており、ミクロンサイズの物体の直径が後方散乱信号のパターンに影響を与えることを裏付けています。しかし、ポリスチレン微小球の結果も細胞の実験結果とは異なりました。細胞の分類では、周波数スペクトル解析が波形解析よりも優れており、周波数スペクトルの時間的変化が分類精度に寄与しました。ただし、微小球の分類では、波形および周波数スペクトル分析がスペクトログラム分析を上回りました。この結果は、波形信号と周波数スペクトルがミクロンサイズの物体のサイズの違いを決定するのに十分な特徴を含んでいることを示しています。さらに、周波数スペクトルの時間的変化の特徴がサイズ分類するには過剰であると推測できます。基本的に、後方散乱信号のパターンには細胞の直径だけでなく、細胞のより多様な特性（構造材料や細胞膜の特性など）が含まれており、スペクトログラムはこれらの特性を表すことができます。この結果は、より抽象的な自動診断タスクに後方散乱パターンを利用するにはスペクトログラム解析が必要であることを示しています。

さらに一歩進めるために、提案されたシステムが同様のサイズのポリスチレン微小球から細胞を区別できるかどうかを調べました。以前の実験で後方散乱信号がサイズの違いを反映していることが示されたため、この実験ではサイズの違いの可能性を排除して構造材料の違いの影響を調査しました。 PNT1A 細胞 (\(10.10 \pm 0.88\;\upmu\)m) と 10 \(\upmu\)m ミクロスフェア (\(9.97 \pm 0.07\;\upmu\)m) および RBC (\提案されたシステムを使用して、5 \(\upmu\)m の微小球 (\(4.98 \pm 0.06\;\upmu\)m) から (6.57 \pm 0.66\;\upmu\)m)。表 3 は、2 つの分類タスクの精度を示しています。

表 3 に要約されているように、提案された分類器は、RBC と 5 \(\upmu\)m の微小球を正確に区別しましたが、PNT1A と 10 \(\upmu\)m の微小球については高い分散を示しました。この結果は、部分的にはサイズが異なるという事実に起因している可能性があります。 RBC と 5 \(\upmu\)m マイクロスフェア間の差は、PNT1A 細胞と 10 \(\upmu\)m マイクロスフェア間の差よりも有意でした。さらに、比較的小規模なデータセットでは、分類器が PNT1A 細胞と後方散乱信号によって反射される 10 \(\upmu\)m 微小球の間の構造材料の違いを理解するには不十分である可能性があります。今後の研究では、このデータセットの範囲と規模の拡大を試みる予定です。ただし、分散が大きいにもかかわらず、提案された分類器は、PNT1A の検出において 3 つの分類器の 2 倍の完璧な精度を示しました。したがって、分類器はミクロンサイズの物体の構造材料の違いやサイズの違いを捉えることができると考えられます。さらに、この実験では、スペクトログラム解析が他のケースよりも大幅に優れていましたが、最初の実験ではスペクトルとスペクトログラム解析の両方が完璧なパフォーマンスを示しました (表 1)。周波数スペクトルの時間的変化は、静的な周波数スペクトルや波形信号よりも細胞 (および微小球) の構造材料に関するより豊富な情報を表す可能性があります。

このセクションでは、セル特性解析 (RQ 2 および RQ 3) に対する周波数スペクトルとその時間的変化の有効性を検証します。表 1 にリストされているように、周波数スペクトル分析とスペクトログラム分析の両方で、高い平均精度と低い分散で 2 つの細胞タイプを互いに区別できました。基本的に、周波数領域の特徴は、時間領域の特徴よりも後方散乱信号によって引き起こされるセル特性をより効果的に明らかにします。さらに、表 3 は、時間周波数領域の特徴が他の 2 つのデータ表現よりも有用であることを示しています。この結果は従来のML法と同様の結果であった（表1下段）。ただし、時間と空間の複雑さに対処するために、上記の実験ではサブサンプリングによってスペクトログラム解析の周波数分解能を 5000 から 513 に下げました。同時に、スペクトル解析の周波数分解能を 5000 に維持しました。したがって、以前の実験結果は RQ 3 をサポートするには不十分です。この問題に対処するために、125 ～ 2000 の周波数分解能に基づいてスペクトルおよびスペクトログラム解析の精度を検証しました。ステップサイズは \(+ 125\) です。図 5 に実験結果を示します。

図5に示すように、スペクトログラム解析は周波数分解能に関わらず安定した高い精度を示し、周波数スペクトル解析を上回りました。対照的に、周波数スペクトル解析のパフォーマンスは不安定な傾向を示しました。周波数分解能が1750になるまで、周波数スペクトル解析の\(F_1\)測定値は0.70未満でした。特に、その精度は再現率よりもはるかに厳しいものでした。周波数スペクトルの分解能が 2000 より低い場合、後方散乱信号によって反映されるセル特性は消失します。この場合、表 1、2、および 3 の以前の実験結果は、周波数スペクトルの時間解析により、静的解析とは異なるセル特性の明確な側面が発見されたことを示しています。さらに、周波数分解能を下げると、時間解析の方が静的解析よりも計算効率が高くなります。

提案システムで使用されるノイズ低減方法のアブレーションテストを実施しました。提案されたシステムの顕著なパフォーマンスは、提案された CNN モデルが過剰に機能しており、従来の機能で細胞分類が可能であるかもしれないという誤解を引き起こす可能性があります。ただし、細胞の後方散乱信号は非常にノイズが多く、従来のヒューリスティックを使用してノイズの下で重要な特徴を抽出することはより困難です。私たちは、ノイズ除去オートエンコーダーとガウスノイズ注入のアブレーションテストを通じてこれを実証しようとしました。 RBC と PNT1A 細胞を分類するために提案されたノイズ除去方法 (DN+) を使用する提案システムのパフォーマンスを、ノイズ除去オートエンコーダーのみを使用する場合 (DN) とノイズ除去技術を使用しない場合 (Raw) と比較しました。表 4 は、提案されたノイズ除去方法が自動細胞型分類システムの精度に与える影響の実験結果を示しています。

表 4 にリストされているように、3 つのケースは波形およびスペクトログラム解析において同様の精度を示しました。ただし、周波数スペクトル分析では、DN+ が他の 2 つのケースより明らかに優れていました。この結果は、我々のノイズ低減方法がセルからの後方散乱信号の周波数領域の特徴を効果的に回復することを示しています。それにもかかわらず、提案されたノイズ除去オートエンコーダは、ガウスノイズ注入なしでは分類精度に貢献できませんでした。ガウスノイズ注入を使用したデータ拡張により、提案されたオートエンコーダーと分類器をトレーニングして、重要な信号特徴をノイズから区別できるようになりました。さらに、3 つの分類器はすべて同じデータ拡張手法 (ノイズ除去ステップだけでなく) を使用してトレーニングされましたが、ノイズは周波数スペクトル分析にのみ影響しました。したがって、後方散乱信号の時間的特徴は周波数領域の特徴よりもノイズに対して強いと推測できます。

この研究は、細胞の後方散乱信号のパターンを分析することにより、細胞の種類に基づいて生細胞を自動的に分類することを目的としていました。以前の研究 28 では、手動の後処理で後方散乱信号の IB 係数を測定することにより、ラベルフリーの音響センシング技術を適用して、RBC と PNT1A がん細胞のサイズの違いを決定しました。しかし、後方散乱信号のパターンを自動的に分析することで、時間のかかるプロセスや手動分析によって引き起こされる可能性のあるエラーを回避することができました。この研究では、捕捉された単一物体 28 のラベルフリー音響センシングと 1D 畳み込みオートエンコーダーおよび CNN 分類器を組み合わせることにより、新しい自動細胞型分類システムを実証しました。実験と研究の質問は、提案されたシステムの各モジュールの有効性を検証するために設計されました。まず、提案したシステムを 2 種類の細胞 (RBC および PNT1A) と 2 種類のポリスチレン微小球 (5 および 10 \(\upmu\)m) に適用することにより、細胞種類を分類するための後方散乱信号のパターンの有効性を検証しました。細胞と微小球を使用して、(1) 赤血球とがん細胞、(2) 異なるサイズのポリスチレン微小球、(3) 同様のサイズの細胞とポリスチレン微小球を特定する 3 つの実験を実施しました。また、後方散乱信号の特徴の種類 (時間領域や周波数領域など) がミクロンサイズの物体の物理的特性と相関しているかどうかを調べるために、3 つの前処理方法を比較しました。実験結果は、後方散乱信号パターンが細胞の直径や構造材料の違いなどの他の物理的特性を反映していることを示しており、これは細胞の状態や疾患プロセスに関連する基本的な分子、構造、および行動の変化との関係を理解することの重要性を明らかにしています63,64。したがって、時間領域と周波数領域の両方の特徴がセルの特性を分析する上で重要でした。 ML モデルに関しては、従来の ML モデルとの性能比較により CNN 分類器の必要性が実証され、アブレーションテストに基づいてノイズ除去オートエンコーダーの有効性が検証されました。

表 1 と 2 では、サイズの違いが、粒子または細胞からの後方散乱信号のパターンに影響を与える重要な要因の 1 つである可能性があります。その結果、我々は先行研究と一致する結論に達した28。ただし、表 3 に要約されているように、提案されたシステムは、同様のサイズのポリスチレン微小球から細胞を区別する際に高い精度を示しました。この結果は、構造材料の物理的特性も、サイズだけでなく後方散乱信号パターンにも影響を与えることを示しています。提案されたシステムは、PNT1A と 10 \(\upmu\)m の微小球の分類に大きなばらつきがあるにもかかわらず、5 \(\upmu\)m の微小球から赤血球を正確に区別しました。この結果は、構造材料だけでなくサイズの違いによるものである可能性があります。 RBC と 5 \(\upmu\)m マイクロスフェアのサイズ差は、PNT1A 細胞と 10 \(\upmu\)m マイクロスフェア間のサイズの差よりわずかに大きかったが、細胞機構に伴う微細構造の違いが二次的な要因として寄与している可能性があります。。以前の研究では、周囲の細胞質と比較して、物体が密に詰まっている細胞核は最も硬いことが示されており65、66、哺乳動物細胞における核の平均直径は約5から20 \(\upmu\)mであり67、これはあるいは赤血球の平均直径よりも大きい場合もあります。対照的に、哺乳動物の赤血球は成熟すると細胞核を持たず 68、毛細血管を効率的に移動できるように容易に変形します 69。さらに、光学では、細胞核は細胞質と比較して異なる屈折率と質量密度を持っています70,71。したがって、このような微細構造の違いと細胞機構の違いは、PNT1A 細胞と 10 \(\upmu\)m のマイクロスフェアを、RBC や 5 \(\upmu\)m のマイクロスフェアと比較して分類する際の高い分散に関与している可能性がありますが、これは集中的に行われます。将来的には大規模なデータセットを使用して探索される可能性があります。

表 1 に示すように、提案されたシステムは細胞分類に関して優れた精度を示しましたが、従来の方法は精度が低かったことがわかりました。これらの結果は、深層学習を強化したモデルの使用が過剰になる可能性があり、従来の方法で適切に設計されたシステムは、同等のパフォーマンスを達成します。しかし、その後の実験 (図 5 および表 4) では、提案されたシステム (特にスペクトログラム解析の場合) が低周波数分解能とノイズ除去の不在を克服できることが示されました。細胞からの後方散乱信号は望ましくないノイズを伴った微小なものであったため、従来の ML アルゴリズムやヒューリスティックベースの手動手法では、ノイズやわずかな反射の中から細胞の特性に関連する重要な特徴を発見できると期待するのは困難です。さらに、これらの結果は、時間領域と周波数領域の特徴を組み合わせることで、セル特性の発見の精度、ノイズに対する堅牢性、および解像度の低下が向上することを示しています。基本的に、周波数スペクトルの時間的変化には、静的な周波数スペクトルや波形信号よりも、サイズや構造材料を含む細胞の物理的特性に関するより豊富で特徴的な情報が含まれている可能性があります。

提案されたシステムは、以前の研究と比較して、手動の後処理を使用せずに生細胞を正確に分類できます28。それにもかかわらず、提案されたシステムには、将来の研究で対処する必要があるいくつかの制限があります。まず、2 種類の細胞 (RBC と PNT1A) と 2 種類のマイクロスフェア (5 および 10 \(\upmu\)m) を使用して実験を行いました。私たちは、同様のサイズの細胞とミクロスフェアを分類することで、システムがさまざまな細胞の特性（直径だけでなく）を考慮できることを実証しましたが、この概念を検証するには、さらなる研究でさまざまなサイズのより多くの細胞タイプを調べる必要があります。セルと後方散乱信号の数も増やす必要があります。この研究では、24 個の細胞から 154 個のシグナル、および 31 個のポリスチレン微小球から 146 個のシグナルを収集しました。相互検証の結果は、提案されたシステムの高精度はオーバーフィッティングによるものではないことを示しましたが、細胞とサンプルの数は生細胞の多様性を示すのに十分ではありませんでした。データセットを拡張することで、私たちの今後の研究は、細胞の物理的特性と機能的特性の間の相関関係と、細胞からの後方散乱信号のパターンを発見することに焦点を当てていきます。発見された相関関係は解明され、その後、疾患の進行と治療反応を含む臨床医学に応用される可能性があります。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

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この研究は、助成金第 2 号に基づいて国立衛生研究所によって部分的に支援されました。 P41-EB002182 (KKS)、一部は韓国国立研究財団 (NRF)、韓国政府 (MSIT) が資金提供する助成金 (番号 2022R1F1A1065516) (O.-JL)、一部は韓国国立研究財団 ( NRF) 韓国政府 (MSIT) (No. 2022R1A5A8023404) (HGL) からの助成金、および一部は研究開発プロジェクト「韓国大気予測システム研究院 (KIAPS) による次世代データ同化システムの開発」によるものです。韓国気象庁 (KMA2020-02211) (H.-JJ) によって資金提供されました。

これらの著者、Hyeon-Ju Jeon と Hae Gyun Lim も同様に貢献しました。

データ同化グループ、韓国大気予測システム研究所、ソウル、07071、韓国

チョン・ヒョンジュ

釜山国立大学生物医工学部、釜山、48513、韓国

ヘギュン・リム

南カリフォルニア大学生物医工学部、ロサンゼルス、カリフォルニア州、90089、米国

K・カーク・シュン＆ミンゴン・キム

韓国カトリック大学人工知能学部、富川市、14662、韓国

オジュン・リー

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MGK、O.-JL、HGL がこのアイデアを考案しました。 MGK と KKS は超音波実験を設計し、実施しました。 H.-JJ と O.-JL はデータを分析しました。 O.-JL、HGL、MGK がデータを解釈しました。 H.-JJ と MGK が原稿を作成しました。著者全員が結果を検討し、原稿の最終版を承認しました。

O-Joun Lee または Min Gon Kim との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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Jeon, HJ.、Lim, HG、Shung, KK 他拡張畳み込みニューラルネットワークとラベルフリーの音響センシングを組み合わせた自動細胞タイプ分類。 Sci Rep 12、19873 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-22075-6

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受信日: 2022 年 5 月 17 日

受理日: 2022 年 10 月 10 日

公開日: 2022 年 11 月 18 日

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